Wpływ koinfekcji wirusem GB C na przeżycie wśród pacjentów z zakażeniem wirusem HIV cd

Badanie zostało zatwierdzone przez instytucyjną komisję egzaminacyjną Uniwersytetu w Iowa, a wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę. RNA ekstrahowano z surowicy lub osocza (200 .l) za pomocą poprzednio opisanej metody ekstrakcji izotiocyjanianu guanidyny18; jedna czwarta preparatu RNA została wykorzystana w zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) w celu powielenia RNA GBV-C (z użyciem starterów z nieulegającego translacji regionu 5 ). 18, 19 produktów PCR zidentyfikowano przez elektroforeza w żelu agarozowym i barwienie bromkiem etydyny.18 Próbki do kontroli negatywnej i próbki kontroli pozytywnej włączono do każdej próbki poddawanej testom PCR. Aby zostać uznanym za pozytywny, próbka musiała wykazać wynik dodatni w dwóch różnych przypadkach lub dwie próbki uzyskane w różnych datach musiały wykazać wynik dodatni. Pracownicy laboratorium nie byli świadomi stanu klinicznego pacjentów, których próbki testowali.
Komórki i wirusy
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej wyizolowano od zdrowych dawców krwi i inkubowano w pożywce RPMI 1640 zawierającej fitohemaglutyninę i interleukinę-2 przez 48 godzin przed zakażeniem GBV-C, HIV lub oboma, jak opisano wcześniej.15 Żywotność komórek mierzono za pomocą trypanu -niebieskie studia wykluczające. Określiliśmy stopień syntezy białka w zakażonych pozornie (kontrolnych) i zakażonych GBV-C komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej poprzez metaboliczne znakowanie białek komórkowych za pomocą [35S] metioniny i określenie zliczeń na minutę ich inkorporacji przez strącanie kwasem, jak poprzednio opisano. 20 Izolat GBV-C stosowany w tym badaniu pochodził z płynów supernatantu z hodowli komórkowych, które uprzednio transfekowano transkryptami RNA pełnej długości GBV-C i przepuszczano trzy do sześciu razy w hodowlach komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Podobnie preparaty kontrolne infekowane próbą otrzymano z płynów supernatantu z niezakażonych hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.16 Objętość zakażonego pozornie supernatantu znormalizowano tak, aby był równy objętości supernatantu zakażonego GBV-C.
Izolat HIV stosowany w tych badaniach był szczepem wywołującym niedotlenienie (National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program szczep 92UG031, nr katalogowy 1741). Preparaty HIV były rozmnażane jak opisano wcześniej. Po aktywacji w fitohemaglutyninie i interleukinie-2 przez dwa dni, płukano 1×106 komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, a następnie ponownie zawieszano w 100 .l preparatu zawierającego HIV, GBV-C lub oba (krotność infekcji, około 0,1). Zmienialiśmy także czas zakażenia HIV lub GBV-C w niektórych kulturach. Wirusowe izolaty dodano do komórek przez cztery godziny w 37 ° C przed dodaniem 2 ml świeżej pożywki, po czym komórki inkubowano przez noc. Komórki przemyto, a próbki supernatantu z hodowli zebrano natychmiast, a następnie dwa razy w tygodniu. Replikację HIV określono przez pomiar antygenu p24 HIV w supernatantach hodowli, 21, 22 i replikację GBV-C określono przez pomiar pozytywnego RNA w supernatantach hodowli i RNA o pozytywnym i negatywnym znaczeniu w lizatach komórkowych, jak poprzednio. opisany.16
Cytometrii przepływowej
Poziom ekspresji receptorów HIV (CD4) i głównych koreceptorów (receptora CXC 4 [CXCR4] i CCR5) na jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej po zakażeniu GBV-C określano za pomocą cytometrii przepływowej (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, Calif 16,21 Komórki zostały zainfekowane GBV-C lub zostały zakażone pozornie
[podobne: diagnoza genetyczna, dobry gastrolog białystok, infekcyjne zapalenie wsierdzia wytyczne ]
[więcej w: puchar orlika, przeszczep przeciwko gospodarzowi, trombocytoza ]